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Polymerase-Kettenreaktion

Wenn man Pflanzen kreuzt, werden die neuen Merkmale oft erst an den ausgewachsenen Pflanzen sichtbar. Möchte man vorher wissen ob ein Keimling die gewünschte Kombination von Eigenschaften erhalten hat, kann man im Labor seine DNA vervielfältigen und untersuchen.

Poster - PCR - Polymerase-Kettenreaktion - PDF öffnet in neuem Fenster

 

Wie schon im Abschnitt über Vererbungslehre erklärt, wird DNA in jeder Zelle kurz vor der Zellteilung von bestimmten Enzymen, den Polymerasen, verdoppelt. Diese Enzyme können aus einzelsträngiger DNA wieder doppelsträngige DNA herstellen. Die Forscher benutzen diese Polymerasen dazu, auch im Reagenzglas DNA-Kopien anzufertigen. Die Technik heißt demzufolge Polymerase-Kettenreaktion oder abgekürzt PCR (von engl. Polymerase Chain Reaction).

 

 

 

 

 

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Aufschmelzen oder Denaturierung

 

 

1. Phase – Das Aufschmelzen (Denaturierung)

Ähnlich wie bei der Zellteilung wird die DNA zunächst aufgeschmolzen. Die gegenüberliegenden Basen, die sich sonst wie mit Händen aneinander festhalten, lassen bei hohen Temperaturen von etwa 95°C voneinander ab und man erhält zwei Einzelstränge. Die Reihenfolge der Basen am Anfang und am Ende des zu vermehrenden Bereiches müssen bekannt sein, damit sich im nächsten Schritt die Primer anlagern können.

 

2. Phase – Die Anlagerung (Primerhybridisierung o. primer annealing

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Primerhybridisierung (primer annealing)

Ein Primer ist ein Einzelstrang aus wenigen Basen, der sich bei etwas kühleren Temperaturen um die 60°C an eine Stelle der DNA anlagern kann, die genau die entgegengesetzte Basenreihenfolge aufweist. Ein Primer mit den Basen AAAGGG lagert sich zum Beispiel an ein DNA-Stück mit den Basen TTTCCC an. Die Primer dienen einerseits als Startpunkt für die Polymerase und definieren gleichzeitig die äußeren Grenzen, innerhalb derer der DNA-Strang verdoppelt werden soll.

 

3. Phase – Die Verlängerung (Elongation)Polymerase-Kettenreaktion (PCR) - Verlängerung (Elongation)

Die wässrige Lösung mit den DNA-Strängen und ihren angelagerten Primern wird jetzt wieder erhitzt, bis die optimale Arbeitstemperatur der Polymerase erreicht wird. Hitzestabile Polymerasen wie die oft verwendete Taq-Polymerase arbeiten am besten bei Temperaturen um die 70°C und verknüpfen bis zu 1000 Basen pro Minute. Je nachdem, wie lang der DNA-Strang ist, der verlängert werden soll, dauert es also nur wenige Minuten bis aus einem DNA-Doppelstrang zwei geworden sind.

 

Und warum Kettenreaktion?

Natürlich braucht man viel mehr Kopien, deswegen geht der ganze Prozess gleich in die nächste Runde. Es wird erhitzt, die Doppelstränge schmelzen auf, Primer lagern sich an und die Polymerase fügt die richtigen Basen ein. Nach zwei Zyklen hat man schon vier DNA-Stränge, nach drei Zyklen sind es acht und nach 25 Durchgängen hat man aus einem DNA-Strang fast 17 Millionen Kopien erzeugt. Genug, um damit weitere Experimente durchzuführen.

 

Quantitative PCR – Eine Sonderform

Wie in der normalen PCR wird auch in der quantitativen PCR die DNA zunächst aufgeschmolzen, wodurch sich ein Primer anlagern kann. Zusätzlich zum Primer kommen hier noch DNA-Sonden zum Einsatz. Diese kurzen DNA-Stücke tragen zwei verschiedene  Farbstoffe, einen Reporter, der leuchtet und einen Quencher, der das Leuchten unterdrücken kann, wenn er nahe genug an den anderen Farbstoff herankommt. Die Polymerase beginnt nun ihre Arbeit und führt die Primer-Verlängerung (Elongation) durch, wodurch sie die Sonde Stück für Stück vom DNA-Strang löst. Aus dem einen DNA-Strang werden zwei gleiche DNA-Stränge und sobald dieser Prozess beendet ist, ist auch die Sonde vollständig abgelöst. Sie liegt nun in Einzelteilen vor, wodurch die beiden Farbstoffe räumlich voneinander getrennt sind, so dass der erste Farbstoff vom Quencher nicht mehr unterdrückt wird und leuchten kann. Dieser Prozess wird nun auch hier mehrmals wiederholt (bis zu 50 Zyklen) und das Leuchten des Reporters wird pro Zyklus gemessen.

quantitative PCR

Das Leuchten zeigt eine erfolgreiche PCR-Reaktion an. Parallel wird ein Referenzgen gemessen und die Menge des untersuchten Gens kann mit Hilfe dieser Referenz bestimmt werden. Es wird quantifiziert, d.h. man kann ein Gen nicht nur nachweisen, sondern auch feststellen, in welcher Menge es vorliegt.

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