Kategorie: Molekularbiologie

Grundlagen und Einsatz

Blotting: Western, Norther, Southern Blot

Mit Hilfe der verschiedenen Blotting-Methoden ist es Möglich DNA (Southern Blot), RNA (Northern Blot) oder ganzen Proteinen (Western Blot) von einem Elektrophorese-Gel auf eine Zielmembran zu übertragen, um sie biochemisch nachzuweisen. Hiermit kann man diese Moleküle nun identifierzieren und quantifizieren. Die Gel-Elektrophorese erklären wir euch in diesem Beitrag: Gel-Elektrophorese.

Anhand der Forschungsarbeit unserer Doktorandin Mercedes wollen wir euch im folgenden die drei Methoden genau erklären und vorstellen.

Um die Fotosynthese bei Pflanzen besser zu verstehen, hat Mercedes – Doktorandin am Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie in Potsdam-Golm – in eine Tabakpflanze ein Gen eingebracht, das die Fotosynthese verbessern könnte. Wie sie das Gen in die Pflanze einbringt und wie sie in ihrer Forschung vorgeht, hat sie in dem Film „Vom Gewächshaus ins Labor“ bereits gezeigt.

Nun muss sie schauen, ob das Gen, das sie interessiert tatsächlich in das Erbgut der Pflanze eingebracht wurde, ob es dort aktiv ist und ob es last but not least auch tatsächlich das entsprechende Protein bildet. Dazu trennt sie zunächst jeweils die verschiedenen Bestandteile (DNA, RNA, Proteine) durch Gel-Elektrophorese nach ihrer Größe auf. Die aufgetrennten Moleküle macht sie anschließend durch die Methode des Southern, Northern bzw. Western Blot sichtbar. So kann sie feststellen, ob das Gen ins der pflanzliche Genom integriert ist, ob es aktiv ist und ob auch tatsächlich das entsprechende Protein gebildet wird. Ist dies der Fall, so kann sie weiter untersuchen, welche Wirkung das eingebrachte Gen auf die Fotosynthese hat, ob es tatsächlich die Fotosynthese verbessert oder eher das Gegenteil der Fall ist.

Die Bezeichnungen Southern, Northern und Western Blot haben nichts mit den Himmelsrichtungen zu tun. Edwin Southern entwickelte in den 70er Jahren die molekularbiologische Methode zur Untersuchung von DNA-Sequenzen. In Anspielung an seinen Namen wurde der Nachweis von RNA-Sequenzen mit Northern Blot bezeichnet und der Nachweis von Proteinen als Western Blot.

In unserer Video-Reihe „Pimp your brain“ erklären Wissenschaftler des Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie, wie sie bei ihrer Forschung vorgehen.

Weitere Videos findet Ihr auf unserem Youtube-Kanal!

Weitere Infos zum Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie gibt es unter http://www.mpimp-golm.mpg.de.

Gelelektrophorese

Die Gel-Elektrophorese ist eine in der Molekularbiologie, Biochemie und Lebensmittelanalytik häufig eingesetzte Methode um verschiedene Moleküle voneinander zu trennen.

Mercedes Diez Cocero möchte die Fotosynthese der Pflanzen besser verstehen. Die spanische Doktorandin am Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie in Potsdam-Golm hat deshalb ein Gen in Tabakpflanzen eingebracht, das die Fotosynthese verbessern könnte.

Wie sie das macht, wie sie die Pflanzen im Gewächshaus anzieht und wie sie die Pflanzen für die Analyse aufarbeitet erläutert sie in diesem Filmbeitrag.

Wie Mercedes in ihrer Forschung vorgeht, hat sie zuvor im Film „Vom Gewächshaus ins Labor“ erklärt.

Weitere Videos findet Ihr auf unserem Youtube-Kanal @MPIMP Potsdam Golm!

Weitere Infos zum Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie gibt es unter: www.mpimp-golm.mpg.de

Molekulare Marker

Pflanzenzüchtung ist ein sehr zeitaufwändiger Prozess, da viele Merkmale erst in der ausgewachsenen Pflanze sichtbar werden. Mit Hilfe von molekularen Markern kann man aber bereits aus der DNA-Sequenz auf bestimmte Eigenschaften schließen und somit den züchterischen Aufwand extrem verringern.

Molekulare Marker sind nichts anderes als kurze Abschnitte von DNA, deren Sequenz und Lage im Genom genauso bekannt sind wie der Zusammenhang zwischen dem Auftreten des Markers und einer Eigenschaft in der Pflanze. Wenn zum Beispiel eine bestimmte Basenreihenfolge nur bei besonders hitzeresistenten Pflanzen auftritt, dann ist diese Basenreihenfolge der molekulare Marker für Hitzeresistenz. Molekulare Marker können – müssen aber nicht – identisch mit dem Gen für die Eigenschaft sein. Es reicht aus, wenn die Markersequenz sich so nah an dem Zielgen befindet, dass beide immer gemeinsam vererbt werden und man vom Vorhandensein des Markers eindeutig auf das Vorhandensein des Zielgens schließen kann. Der Marker ist sozusagen der Anhänger am Schlüsselbund. Wenn man in seiner Hosentasche den Anhänger ertastet, so kann man sich sicher sein, auch die daran hängenden Schlüssel eingepackt zu haben.

In dem Bild auf der rechten Seite ist zum Beispiel ein bestimmter Genabschnitt mit den Genen für die Korngröße assoziiert (dargestellt in orange oder gelb) während eine andere Sequenz gemeinsam mit den Genen für die Halmform auftritt (dargestellt in hellgrün oder dunkelgrün).

Ob sich ein molekularer Marker in der Pflanze befindet, kann man zum Beispiel mit Hilfe von DNA-Sequenzanalysen herausfinden. Dabei wird die Basenreihenfolge der DNA abgelesen und auf das Vorhandensein des molekularen Markers geprüft. Nur die Jungpflanzen, welche den Marker und damit höchstwahrscheinlich auch das gewünschte Gen aufweisen, werden weiter aufgezogen und vermehrt. Da die Zeit für die Züchtung durch solche molekularbiologischen Methoden extrem verkürzt wird, hat sich dafür der Begriff „Smart Breeding“, also „Intelligente Züchtung“, eingebürgert.

Wie molekulare Marker konkret in der Züchtung eingesetzt werden können und wie die Forschung die Züchter bei der Auffindung von Markern unterstützen kann, wird im folgenden „pimp your brain“ Video erklärt:

Was ein Textmarker ist, weiß jeder. Was ist aber mit einem Marker gemeint, wenn es um Pflanzenforschung geht und was versteht man unter Marker-unterstützte Selektion? Karin Köhl vom Max-Planck-Institut für molekulare Pflanzenphysiologie in Golm bei Potsdam gibt in diesem „pimp your brain“ Beitrag darauf die Antworten.

Welche Sequenzen dienen als molekulare Marker?

Molekulare Marker befinden sich oft in der nicht-codierenden DNA, also in den Bereichen des Genoms, die nicht in Proteine umgeschrieben werden. Es handelt sich dabei zum Beispiel um kurze Tandemwiederholungen wie ATCATCATCATC (engl. Short Tandem Repeats = STR) oder Punktmutationen (engl. Single Nucleotide Polymorphisms = SNP).

Wozu braucht man Marker noch?

Marker kommen auch bei der Transformation, also dem Einfügen fremder Gene in einen Organismus, zum Einsatz. In diesem Fall spricht man von Selektionsmarkern: Da die Transformation mit Agrobakterien oder mit der Genkanone nicht bei allen Zellen funktioniert, muss man die erfolgreich transformierten Zellen selektieren, also auslesen. Aus diesem Grund koppelt man das Zielgen an ein Markergen, welches zum Beispiel die Information für eine Antibiotikaresistenz verschlüsselt. Die transformierten Pflanzenteile werden dann auf einem antibiotikahaltigen Nährboden kultiviert. Dabei überleben dann nur die erfolgreich transformierten Pflanzen, da nur sie das Resistenzgens besitzen. Auch Gene, die der Pflanzenzelle die Aufnahme und Verwertung bestimmter Nährstoffe ermöglichen, kommen als Marker zum Einsatz. Die so transformierten Pflanzenzellen überleben auf Agar der ausschließlich Nährstoffe enthält, die sonst für die Pflanze gar nicht verwertbar wären.

Will man ausschließlich den Erfolg einer Transformation beurteilen ohne die transformierten von den nicht-transformierten Zellen zu trennen, hat sich das grünfluoreszierende Protein (GFP) als besonders praktisch erwiesen. Pflanzenzellen, die dieses Protein exprimieren, leuchten unter UV-Licht grün. Forscher des Max Planck Instituts für Molekulare Pflanzenphysiologie haben diese Methode erfolgreich für Tomaten etabliert

Transformation

Um ein neues Gen in Pflanzen einzuschleusen, benutzen die Forscher oft das Bodenbakterium Agrobacterium tumefaciens. Eine andere Möglichkeit bietet die Genkanone, mit der man DNA-Stücke in Pflanzenzellen hineinschießen kann. Mit dieser Methode kann man auch die DNA von Chloroplasten verändern.

Wenn neue Gene stabil in die DNA von Pflanzen integriert werden, spricht man von einer Transformation. Das bedeutet, dass die Pflanzenzellen diese neue DNA, als Teil ihrer eigenen betrachten, ablesen und die entsprechenden Proteine herstellen.

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Fortpflanzung

Einhäusig – zweihäusig – zwittrig? Pflanzen können verschiedene Blüten ausbilden und mit Hilfe von Wind oder Insekten ihren Pollen auf die Blütennarbe übertragen. Wer sich nicht auf Wind oder Bienen verlassen will, der kann wie die Erdbeere oder die Kartoffel auch auf vegetative Vermehrung zurückgreifen.

Die Vermehrung bei Pflanzen erfolgt entweder sexuell über Bestäubung und Befruchtung oder asexuell über vegetative Fortpflanzung. Bei der sexuellen Fortpflanzung werden in den Staubbeuteln der Pflanzen die männlichen Pollen und im Griffel die weiblichen Eizellen gebildet. Die Blüten verschiedener Arten sind dabei unterschiedlich zusammengesetzt.

  • Zwittrige Blüten vereinen weibliche und männliche Blütenorgane
  • Einhäusige Pflanzen haben getrennte weibliche und männliche Blüten auf derselben Pflanze (z.B. Mais)
  • Zweihäusige Pflanzen haben weibliche und männliche Blüten nur auf getrennten Pflanze (z.B. Brennnesseln)

Manche Pflanzen nutzen ihren eigenen Pollen zur Bestäubung der Narbe (z.B. Gerste und Weizen). Diese Selbstbestäubung hat den Vorteil, dass sich auch in verlassenen unwirtlichen Gebieten aus einer einzigen Pflanze eine ganze Population entwickeln kann.

Andere Pflanzen sind Fremdbestäuber. Sie lassen ihren Pollen von Wind oder Insekten auf andere Pflanzen übertragen (z.B. Mais, Roggen und Sonnenblume). Fremdbestäubung hat den großen Vorteil, dass die Gene durchmischt werden und neue Kombinationen entstehen können, die den Nachkommen vielleicht bessere Eigenschaften verleihen.

Der Pollen von windbestäubten Pflanzen ist meist sehr leicht und klein, damit er sich weit verbreiten kann. Insektenbestäubte Pflanzen besitzen einen schwereren Pollen und zum Anlocken der Insekten besonders große und farbige Blüten.

Bei der vegetativen Vermehrung von Pflanzen werden auf verschiedenen Wegen Klone der Mutterpflanze gebildet, die zu selbständigen Pflanzen heranwachsen können. Dabei kann es sich um Ableger, Rhizome, Knollen oder andere Formen handeln. Ein Beispiel ist die Kartoffel, bei der aus den Augen der Knollen komplette neue Pflanzen heranwachsen können. Erdbeeren können lange Ausläufer bilden, an deren Enden neue Pflänzchen entstehen, die nach Absterben der Verbindung zur Mutterpflanze zu eigenständigen, genetisch identischen Pflanzen werden.

Zellteilung

Wenn Zellen sich teilen, dann sollen beide Tochterzellen genau die gleiche Erbinformation enthalten, wie die Mutterzelle. Damit das klappt, müssen die Chromosomen zunächst einmal verdoppelt werden.

Wir haben gesehen, dass in einem Doppelstrang der DNA nur bestimmte Basen miteinander paaren können. Auch wenn nur ein Strang der DNA bekannt ist, ergibt sich daraus, wie der gegenüberliegende Strang aussehen muss. Genau diese Tatsache ist bei der Verdoppelung (Replikation) der DNA wichtig. Sie beginnt mit der Auftrennung des Doppelstrangs in zwei einzelne Stränge.

Jetzt können Enzyme genau die passenden Basen anlagern und somit zwei neue Doppelstränge erzeugen. Immer wenn die Enzyme Adenin erkennen, fügen sie auf der gegenüberliegenden Seite Thymin an. Bei Cytosin wird auf der anderen Seite Guanin eingebaut und so weiter. Die beiden DNA-Stränge, die auf diese Weise entstehen, werden Schwesterchromatiden genannt. Eigentlich sind sie sogar „Siaemesische Zwillingschromatiden“, denn sie gleichen sich wie ein Ei dem anderen und sind sogar am Zentromer miteinander verbunden. Die Phase des Zellzyklus, in der die DNA verdoppelt wird, wird Interphase genannt.

Abb. DNA-Verdoppelung
Die meiste Zeit liegen im Zellkern fadenförmige 1-Chromatid Chromosomen vor. Die typischen x-förmigen Chromosomen sind nur sichtbar kurz vor bzw. während der Zellteilung (Mitose) bzw. vor der Reduktionsteilung (Meiose). Die übrige Zeit liegen die Chromosomen als diffus aufgelockerte 1-Chromatid-Chromosomen vor, wie dünne Fäden.

Die Mitose – aus eins mach zwei

Auf die Interphase folgt die Mitose, die eigentliche Kernteilung. Damit die langen DNA-Fäden dabei nicht beschädigt werden, werden sie zunächst kondensiert (verdichtet). Die Chromosomen sind dann unter dem Mikroskop als x-förmige Strukturen erkennbar. Den Mittelpunkt des X bildet das Zentromer. Als nächstes lagern sich die Chromosomen in der Äquatorialebene an, also in der Mitte des Zellkerns. Lange dünne Fäden, Spindelfasern genannt, greifen an den Zentromeren an und reißen die Schwesternchromatiden auseinander. Jeweils ein Chromatid jedes Chromosoms wird zu einem der Zellpole gezogen. Dort werden die Chromosomen wieder dekondensiert (entpackt) und es bildet sich eine neue Kernmembran aus. Anschließend teilt sich die Zelle.

Mitose
Mitose

Die Meiose – eine besondere Art der Zellteilung

Bei geschlechtlicher Vermehrung geben die Eltern Erbinformation (Chromosomen) an ihre Kinder weiter. Damit sich nicht mit jeder neuen Generation die Anzahl der Chromosomen verdoppelt, werden Keimzellen gebildet, die nur über den halben Chromosomensatz verfügen. Die meisten Organismen sind diploid und ihre Keimzellen demzufolge haploid. Der Vorgang der Keimzellbildung wird Meiose genannt.

Bei der Meiose ordnen sich die kondensierten Chromosomen paarweise in der Äquatorialebene an. Jeweils ein väterliches und ein mütterliches Chromosom liegen nebeneinander. Genau wie bei der Mitose greifen Spindelfasern an den Zentromeren an. Statt einzelner Chromatide, werden ganze Chromosomen zu den beiden Zellpolen gezogen. Anschließend findet die Zellteilung statt, wie sie oben beschrieben ist.

Erst nach der ersten Teilung werden die Chromosom in ihre beiden Schwesterchromatiden zerlegt und es folgt eine erneute Zellteilung. Aus einer diploiden Zelle sind vier haploide Keimzellen entstanden, deren Erbinformation sich zufällig aus mütterlichen und väterlichen Anteilen zusammensetzt.

Polymerase-Kettenreaktion

Wenn man Pflanzen kreuzt, werden die neuen Merkmale oft erst an den ausgewachsenen Pflanzen sichtbar. Möchte man vorher wissen ob ein Keimling die gewünschte Kombination von Eigenschaften erhalten hat, kann man im Labor seine DNA vervielfältigen und untersuchen.

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RNA-Interferenz

Die Erbinformation ist sehr wertvoll und darf unter keinerlei Umständen beschädigt werden. Deswegen verbleibt die DNA immer im Zellkern. Da die Proteinsynthese aber im Zellplasma stattfindet, wird als Transportform die mRNA genutzt. Diese kann nach Bedarf auf- und abgebaut werden. Der Gehalt an mRNA korreliert mit der Menge an gebildetem Protein. Zerstört man eine bestimmte mRNA, kann auch das von ihr kodierende Protein nicht mehr gebildet werden.

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Erbinformation

Jedes Lebewesen besitzt ein Genom, in dem alle Informationen zum Aufbau der Zellen gespeichert sind. Damit es nicht verloren geht oder beschädigt wird, wird es sicher im Zellkern verwahrt. Das Alphabet des Lebens besteht aus nur 4 Buchstaben. Doch wie kann man in so einer Sprache alle wichtigen Informationen unterbringen und wie werden diese entschlüsselt und vererbt?

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